Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh virus RYSV (Rice Yellow Stunt Virus) chẩn đoán bệnh vàng lụi lúa

Trong khoảng 5 năm trở lại đây, nhiều vụ dịch do virus gây ra đã xảy ra khắp cả nước và đe dọa nghiêm trọng tới ngành sản xuất lúa của Việt Nam. Điển hình là các vụ dịch vàng lùn (do virus lúa cỏ, Rice grassy stunt virus) và lùn xoắn lá (do virus lùn xoắn lá, Rice ragged stunt virus) xảy ra tại miền Nam bắt đầu từ năm 2006 và hiện đã xuất hiện tại miền Bắc. Tiếp theo là dịch bệnh lùn sọc đen do virus lùn sọc đen phương nam (Southern rice black streaked dwarf virus) gây ra tại nhiều tỉnh miền Bắc trong vụ mùa 2009 và hiện đang là vấn đề nóng bỏng tại một số tỉnh phía Bắc. Do đặc điểm triệu chứng cây lúa bệnh là vàng lá nên tác nhân gây bệnh đã được nghi do các nguyên nhân như đất đai, giống, chế độ canh tác. Tuy nhiên các biện pháp phòng chống bệnh theo hướng này đã không thành công. Bệnh vàng lụi đã từng gây ra các dịch bệnh rất nghiêm trọng trên lúa ở miền Bắc trong những năm 1960 và 1970. Mặc dù tác nhân gây bệnh đã được xác định nhưng chẩn đoán bệnh vàng lụi dựa vào triệu chứng là không thể vì triệu chứng điển hình của cây bệnh là “biến vàng”, một triệu chứng có thể do cả yếu tố vô sinh và hữu sinh gây ra. Hơn nữa sự phát triển của dịch bệnh virus trên lúa nói chung và bệnh vàng lụi nói riêng phụ thuộc chủ yếu vào mật độ vector truyền bệnh (rầy) mang virus. Do vậy, việc chẩn đoán sớm và chính xác virus gây bệnh cả trên cây và rầy có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc việc áp dụng hiệu quả các biện pháp phòng chống.

Hiện nay, kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus thực vật phổ biến nhất trên thế giới là thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA). Kỹ thuật ELISA là kỹ thuật đơn giản, tương đối rẻ và được sử dụng để thử trên một số lượng mẫu lớn. Điều kiện để áp dụng kỹ thuật ELISA là có một kháng thể đặc hiệu virus. Cho tới nay, kháng thể đặc hiệu virus vàng lụi vẫn chưa được sản xuất tại Việt Nam và các kít ELISA chẩn đoán virus này cũng không được thương mại hóa trên thề giới. Chính vì vậy, có được một nguồn kháng huyết thanh đặc hiệu sẽ giúp phát hiện sớm virus vàng lụi trên cây lúa và rầy nhằm quản lý hiệu quả bệnh. Ngoài ra kháng thể đặc hiệu virus cũng giúp các nhà khoa học có phương tiện cần thiết để thực hiện các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng về virus vàng lụi.

Nhằm tạo được nguồn kháng thể đặc hiệu hiệu virus vàng lụi (RYSV) nhằm chẩn đoán sớm và chính xác virus gây bệnh trên cây lúa và rầy xanh đuôi đen. Cụ thể là tạo được kháng huyết thanh thỏ đặc hiệu virus vàng lụi RYSV 2, tạo được kit ELISA chẩn đoán virus vàng lụi RYSV trên cây lúa và rầy xanh đuôi đen và ứng dụng ELISA tạo được để chẩn đoán bệnh vàng lụi trên cây lúa và rầy xanh đuôi đen, nhóm nghiên cứu do TS. Hà Viết Cường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đứng đầu đã kiến nghị và được chấp thuận nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh virus RYSV (Rice Yellow Stunt Virus) chẩn đoán bệnh vàng lụi lúa”. Phạm vi nghiên cứu chính của đề tài là chẩn đoán virus vàng lụi lúa cụ thể là kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học dựa trên ELISA.

Sau một thời gian triển khai nghiên cứu, nhóm nghiên cứu đã thu được các kết quả như sau:

1. Tạo nguồn kháng nguyên virus

- Điều tra đồng ruộng tại Hà Nội, Bắc Giang, Hải Phòng và Hải Dương cho thấy bệnh vàng lụi xuất hiện trong vụ mùa từ 2013-2015; nhiều ruộng có tỷ lệ nhiễm rất cao tới 100 %. Sự có mặt của virus vàng lụi trên cây bệnh đã được kiểm tra bằng RT-PCR.

-  Đã lây nhiễm nhân tạo virus vàng lụi từ lúa sang 132 cây lúa bằng rầy xanh đuôi đen trong 3 năm 2013, 2014 và 2015. Các cây lây nhiễm là nguồn bệnh cho các thí nghiệm liên quan tới sản xuất và đánh giá kháng thể đặc hiệu virus. Thí nghiệm lây nhân tạo virus vàng lụi trên cỏ đã xác định ít nhất cỏ lồng vực nước là ký chủ phụ tự nhiên của virus vàng lụi.

-  Đã thu thập 16 mẫu (mỗi mẫu ~ 2000 rầy) từ ruộng lúa nhiễm bệnh nặng (TLB >80%). Sự có mặt của virus vàng lụi trong rầy đã được được kiểm tra bằng RT-PCR. Đã duy trì 2 quần thể rầy xanh đuôi đen (đều được thu thập tại Bắc Giăng) trong 2 năm 2013 và 2014. 15. Đã tạo ra được 3 nguồn kháng nguyên của virus vàng lụi là virus tinh chiết từ mô cây, protein N của virus được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli và dịch nghiền gel polyacrylamide chứa protein N. Lượng virus và protein N thu được đạt lần lượt 12 mg và 20 mg (bằng do OD A280).

2. Thử nghiệm tạo kháng thể thỏ đặc hiệu virus

- Sử dụng 3 nguồn kháng nguyên trên để gây miễn dịch trên thỏ tạo ra 3 nguồn kháng huyết thanh (tổng thể tích 120 ml). Hiệu giá của 3 nguồn kháng huyết thanh rất cao, 1/5000 đối với kháng huyết thanh từ nguồn kháng nguyên protein N và dịch nghiền mảnh gel polyacrylamide chứa protein N. Cả 3 nguồn kháng huyết thanh đều có giá trị chẩn đoán, có thể sử dụng trực tiếp ở độ hòa loãng 1/1000. 

- Kháng huyết thanh từ nguồn virus tinh chiết vẫn chứa kháng thể không đặc hiệu. Loại bỏ kháng thể không đặc hiệu bằng màng nitrocellulose, tiếp theo tinh chiết kháng thể bằng sắc ký cột protein A từ kháng huyết thanh đã tạo ra kháng thể IgG (47 mg) đặc hiệu, độ nhạy tốt, có thể phát hiện dễ dàng virus vàng lụi trên cây lúa và rầy xanh đuôi đen và có thể so được với RTPCR.

- Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ELISA cho thấy lá lúa là loại mô phù hợp để kiểm tra ELISA phát hiện virus RYSV. Trong trường hợp số mẫu kiểm tra ít và phân tích định lượng virus RYSV nên sử dụng phương pháp nghiền mô. Trong trường hợp số mẫu kiểm tra nhiều và phân tích định tính có thể sử dụng phương pháp cắt mô. Trong trường hợp không kiểm tra ngay lập tức thì mẫu lá có thể được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh ít nhất 1 tuần mà không ảnh hưởng nhiều tới kết quả phản ứng. Tốt nhất, mẫu nên được làm khô và bảo quản trong tủ lạnh sâu -20 ^oC (ít nhất 2 năm).

- Dựa trên kết quả nghiên cứu, qui trình kiểm tra ELISA phát hiện virus đã được xây dựng cho phép phát hiện chính xác virus vàng lụi trong cây lúa và rầy xanh đuôi đen.

3. Ứng dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus vàng lụi

- Kết quả kiểm tra ELISA trên 1113 mẫu lúa bảo quản khô và 72 mẫu lúa tươi (có triệu chứng) cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm virus vàng lụi ở 5 tỉnh miền Bắc (Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Bắc Giang, Thanh Hóa) rất cao, có thể tới 95.6% (Bắc Giang).

- Kháng thể IgG tinh sạch và kháng huyết thanh (protein N) có thể phát hiện rất tốt virus vàng lụi trên rầy xanh đuôi đen ở mức cá thể. Độ nhạy của kháng thể có thể sánh được với RT-PCR.

- Đã tạo ra được 20 kít ELISA dùng kháng huyết thanh sản xuất được và xây dựng được qui trình chẩn đoán ELISA cho kít này. Sử dụng kít ELISA có thể phát hiện được virus trong mô cây lúa (tốt nhất là mẫu lá, được bảo quản tươi/mát trong vòng 1 tuần; kít cũng có thể phát hiện virus trong mẫu khô bảo quản lạnh (-20 ^oC) ít nhất 2 năm; mẫu lá tốt nhất là được nghiền trong đệm nhưng cũng có thể được xử lý bằng cách cắt nhỏ mẫu rồi cố định vào giếng).

- Một lớp tập huấn kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus vàng lụi lúa dùng kháng thể/kháng huyết thanh sản xuất đã được tổ chức tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới (Học viện Nông nghiệp).